前沿导读

CAR-T细胞疗法的获批彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗，然而，这类疗法在临床推广过程中面临一系列障碍，包括制造复杂、缓慢、成本高昂、细胞来源受限以及患者因病情进展而错失治疗机会。当前，体内基因工程提供了一种替代方案，该方法将基因治疗递送载体直接给予患者，实现体内细胞修饰（图1A）。递送载体涵盖病毒载体（如慢病毒）、脂质体或聚合物纳米颗粒，可递送多种遗传物质。无论采用何种载体，所有体内基因工程策略均面临核心挑战——将遗传物质精准递送至目标细胞。近年来，体内基因工程（尤其是CAR-T细胞领域）已从临床前概念验证阶段迅速发展至临床测试阶段。

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劲帆医药凭借多年在基因治疗载体和肿瘤免疫领域的研究经验，能够为CAR-T及其他细胞治疗研究者提供全流程服务，包括CAR分子设计、具有靶向性病毒载体的设计、CAR病毒制备、免疫细胞制备与表型检测以及体外和体内药效评价。

 

2025年7月，《Molecular Therapy》期刊发表了题为“Targeted in vivo delivery of genetic medicines utilizing an engineered lentiviral vector platform results in CAR T and NK cell generation”的研究论文。首次系统报道了通过设计VSV-G融合蛋白（Gen 2.1 Fusogen）与CD7结合蛋白的组合，实现对T细胞和NK细胞的特异性转导，并在人源化小鼠和食蟹猴模型中验证了体内生成CAR细胞、清除B细胞的治疗效果与安全性。

01 Gen 2.1融合蛋白的合理设计实现了载体的重定向

为实现遗传药物的体内特异性递送，研究人员利用VSV-G蛋白“结合”与“融合”功能相互独立的特性，基于其与天然受体LDL-R的晶体结构，通过计算机模拟识别出Q10和I182关键位点，并假设引入相反电荷突变（如Q10K或I182E）可破坏LDL-R结合而不影响融合活性（图1B）。实验中，构建包膜为不同突变型VSV-G的慢病毒载体，检测其对SupT1细胞的转导能力，发现Q10突变未能有效屏蔽LDL-R结合，而I182D/E突变显著降低了转导活性；进一步通过加入CD7结合子验证融合能力，结果显示引入CD7结合蛋白后，突变载体可恢复对CD7+细胞的剂量依赖性转导，效率接近野生型VSV-G（图1C）。最终对比发现，I182E突变在高滴度下非特异性转导更低，因此被选定为最优的“去靶向”突变位点（图1D、1E）。

 

图1 设计慢病毒载体实现靶向递送

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

02 Gen 2.1融合蛋白和CD7结合蛋白的包膜载体实现靶细胞特异性转导

为验证优化后的CD7结合蛋白的靶向性，研究人员使用CRISPR技术敲除SupT1细胞中的CD7基因，并对其进行转导实验。结果显示，携带Gen 2.1融合蛋白和CD7结合蛋白的载体无法转导CD7缺失细胞，而野生型VSV-G包膜的载体仍可高效转导，说明该平台的转导依赖于CD7的特异识别（图1F）。此外，该平台还展现出良好的通用性。研究人员构建了靶向CD7、CD4和CD8的scFv结合蛋白，并用于转导来自不同供体的PBMCs（外周血单个核细胞，免疫细胞）。结果显示，CD4结合蛋白选择性转导CD4+细胞，CD8结合蛋白转导CD8+细胞，而CD7结合蛋白可同时转导CD4+和CD8+细胞中的CD7+亚群（图1G、1H）。

03 INT2104特异性转导T/NK细胞并产生功能性CAR+细胞

研究人员基于CD7在T细胞和NK细胞中的特异性表达，开发了携带CD20 CAR的慢病毒载体INT2104，通过Gen 2.1融合蛋白与CD7结合蛋白的协同作用，实现对体内T细胞和NK细胞的精准转导（图2A）。体外实验表明，INT2104可有效转导激活的人PBMCs中的CD4+、CD8+ T细胞及NK细胞（图2B），转导效率与传统体外制备的CAR T产品相当；转导后的细胞与CD20阳性B细胞系（Raji、Daudi，图2C、D）共培养时，展现出强效的剂量依赖性杀伤活性，且该活性完全依赖CD20抗原的存在，证实了CAR介导的特异性识别（图2E）；此外，转导细胞可大量分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2等关键效应因子，且CAR+ T细胞的细胞因子表达水平显著高于CAR T细胞，进一步验证其功能活性（图2F-H）。这些结果共同表明，INT2104无需体外扩增即可直接诱导功能性CAR T和CAR NK细胞的生成。

 

图2 INT2104转导过程中生成具有功能性的CAR+细胞

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

04 评估INT2104转导B细胞的风险

无论CAR T细胞产品通过体外制备还是INT2104体内生成，B细胞非预期转导均会有安全性风险。为评估该风险，研究人员在健康供体分离的原代B细胞、套细胞淋巴瘤（MCL）/滤泡性淋巴瘤（FL）/慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者PBMCs及B细胞肿瘤系中测试INT2104转导潜力。结果显示：即使在高感染复数（MOI）下，健康供体原代B细胞也未发生转导（图3A）；测试的B细胞系（Nalmö, DB, VL51, JVM13, Recl）仅在超生理水平MOI时检测到微弱阳性（图3B），与GFP载体无法转导B细胞系的数据一致；MCL/FL/CLL患者的B细胞样本同样未见转导迹象（图3C）。

 

 

图3 评估INT2104转导B细胞的风险

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

05 INT2104转导的PBMCs可杀伤表达CAR20的B细胞

进一步研究非预期转导的CAR20+ B细胞是否仍可被INT2104转导的PBMCs杀伤。研究人员采用WT VSV-G转导人B淋巴瘤细胞系DB，使其表达CAR20和GFP或单独的GFP。将四名供体的INT2104转导PBMCs与上述DB细胞系共培养后，评估CAR介导的细胞毒性（图3D）。结果显示：INT2104转导PBMCs能剂量依赖性杀伤DB细胞，无论其表达CAR20和GFP或单独GFP（图3E）；共培养组存活的DB细胞中CAR+GFP+细胞比例较对照组有升高趋势（图3F），表明表达CAR20的B细胞仍可被INT2104生成的CAR20效应细胞杀伤。

06 静脉输注INT2104至人源化小鼠可生成CAR+ T/NK细胞并清除B细胞

随后，研究人员通过人源化小鼠模型（标准NSG-CD34与Hu-IL15转基因NSG）验证INT2104单次静脉注射效果：标准模型（图4A-F）显示，无论供体B/T细胞比例差异（图4B）或剂量如何，治疗组在第7天时外周血CD20+/CD19+ B细胞均显著下降（图4E），第21天显示完全清除且持续至第47天，同时血液（图4F）及脾/骨髓/肝（图4M）中均检出CAR+ T细胞（含CD4+/CD8+）；Hu-IL15模型（图4G-N）进一步证实NK细胞扩增（4.41-7.46%, 图4J）后，脾脏可定量检测CAR+ NK细胞（≈5%, 图4N），且两模型均实现B细胞清除（图4K）与CAR+ T细胞生成（图4L），全程无小鼠体重下降或死亡，以上结果充分证明INT2104可在体内持久生成功能性CAR T/NK细胞并彻底清除B细胞，且安全可控。

 

图4 静脉注射INT2104至人源化小鼠可生成CAR+ T/NK细胞并清除B细胞

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

07 INT2104输注可清除B细胞肿瘤

为验证体内生成的CAR细胞是否具备真实杀瘤能力，研究人员在携带Raji B细胞瘤的NSG MHC Ⅰ/Ⅱ小鼠模型中开展了功能验证。研究人员先通过注入表达荧光素酶的Raji细胞建立系统性肿瘤负荷，随后注入1×10⁷活化的PBMC，并在第二天给予单次INT2104静脉输注（低剂量6×10⁵或高剂量1×10⁷TU/只）。结果显示，高剂量INT2104组在治疗后22天内实现肿瘤完全清除，低剂量组在26天内亦达成相同效果，而对照组肿瘤持续进展。流式分析显示，CAR+细胞自第14天起出现在高剂量组外周血中，并与B细胞消失时间高度一致。低剂量组中CAR+细胞检出率较低，但仍观察到肿瘤清除（图5）。

 

图5 将INT2104输注至小鼠体内可清除已形成的B细胞肿瘤

（图片来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

 

08 食蟹猴静脉注射INT2104可实现T/NK细胞特异性转导

研究人员继续采用食蟹猴模型展开剂量探索性研究。研究采用嵌合型HIV/SIV gag-pol（xHIV）构建INT2104替代载体（图6A），单次静脉注射2×10⁹TU/kg后第4天进行解剖（图6B）以规避适应性免疫干扰。ddPCR结果显示原病毒DNA在脾/肝/骨髓等高CD7+组织富集，免疫荧光证实CAR蛋白仅表达于脾脏CD3+ T细胞（图6D）和NKG2A+ NK细胞（图6E）以及肝脏CD3+ T细胞（图6F），而肝细胞（HNF4α+, 图6G）、肺组织及巨噬细胞均无表达（表1），同时外周血CD20+ B细胞显著减少53-84%（图6C），证明该载体突破物种限制后仍严格靶向T/NK细胞并介导早期抗肿瘤活性，为临床安全性提供关键证据。

 

图6 静脉注射INT2104至食蟹猴体内可导致T细胞和NK细胞的特异性转导

（表格来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

表1 组织学检测第4天脾脏、肝脏和肺中CAR蛋白表达详情

（表格来源：Andorko JI, et al, Mol Ther., 2025）

 

讨论总结

尽管自体CAR-T细胞产品已成为B细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的标准疗法，但其广泛应用仍面临诸多挑战：患者特异性细胞产品的制备过程复杂，给药前需要进行淋巴细胞清除化疗，以及高昂的成本限制了其可及性。随着靶向递送系统和载体工程技术的进步，体内CAR-T细胞疗法的潜力正在逐步实现，多种技术被用于尝试实现对靶细胞的特异性递送。

本研究开发的INT2104平台采用工程化慢病毒载体，通过融合Gen 2.1与CD7结合蛋白，实现了对T细胞和自然杀伤（NK）细胞的靶向转导。该平台在人源化小鼠和非人灵长类动物（食蟹猴）中系统地验证了其靶向性、安全性和CAR细胞的功能活性。研究提供了体内生成CAR-T/NK细胞并清除肿瘤的实验证据，为开发体内CAR疗法提供了关键的概念验证支持。

目前，INT2104已进入Ⅰ期临床试验阶段（NCT05869566），有望在未来重塑CAR疗法的开发与应用范式，拓展细胞与基因疗法的可及性与临床应用范围。