自2016年首次发现猪圆环病毒PCV3以来，研究已经确定PCV3在全球至少24个国家和地区流行，PCV3阳性率也不断增加。疫苗免疫是控制猪圆环病的有效手段，尽管PCV2疫苗制造已经非常成熟，但圆环病毒的PCV3基因序列和Cap蛋白，与PCV2都有较大差别，是不同的另一种病毒，PCV2疫苗研制技术方法并不一定适合PCV3，多个新的技术难题需要攻克，这些可能是PCV3疫苗虽是市场急需却至今未上市的原因。

昆虫杆状病毒表达系统作为成熟的蛋白表达平台，相较其他系统，在制备病毒样颗粒（VLP）更具优势：1）杆状病毒本身携带多种类型启动子，包括极早期启动子、早期启动子、晚期启动子和极晚期启动子等，可以控制蛋白在细胞合适状态下的时空表达；2）杆状病毒的启动子包含多种弱启动子和p10或polh两个非必须基因的强启动子，蛋白的表达可以被精确调控，其中的两个强启动子可用于蛋白的高水平表达；3）杆状病毒含有多个增强子、非必须基因、顺时作用元件等，可以容纳较大片段的删除与插入，实现蛋白多拷贝、多亚基或多个不同功能蛋白的单细胞内高水平、稳定表达，同时病毒感染细胞后、细胞并未很快裂解死亡，有长时间的蛋白表达时间，因此外源蛋白表达可达到总细胞蛋白的25-50%以上；4）杆状病毒仅仅感染节肢动物、无致癌性，昆虫细胞无致瘤性，蛋白表达过程采用低温表达（一般不超过27℃），无需添加诱导剂，内毒素低，生物安全性更高；5）蛋白可磷酸化、磷酰基化、酰胺化和糖基化修饰与信号肽切除，即可制备无囊膜VLP，也可以高效制备有囊膜VLP，对于无囊膜动物病毒VLP，因其可能的磷酸化修饰等，相比原核表达系统，昆虫杆状病毒表达系统表达时其结构更加紧密、更接近天然病毒粒子结构，因此免疫原性更强；6）另外，昆虫表达系统除可灵活设计和构建重组病毒载体外，还可对宿主细胞进行多种改造，进而调节VLP的糖基化或进一步提高表达量，以及构建诱导系统和进行无病毒产生体系的蛋白生产等。鉴于昆虫杆状病毒表达系统制备VLP的优势，再结合技术的改进，一些企业目前利用此平台已取得PCV3 VLP疫苗制备的重要突破，该表达系统或将彻底解决PCV3近10年长周期的疫苗研制难题。

1.PCV3感染现状与疫苗市场需求

尽管2016年一项研究显示，PCV3可能是母猪出现繁殖障碍和新生猪急性死亡的病原体，市场对PCV3的致病能力却存在争议。然而2019年以来，国内多项研究已表明单独感染PCV3，亦可导致SPF仔猪或剖宫产仔猪增重减少、引起广泛的组织病理损伤和以Th2辅助细胞严重减少为主的免疫抑制。Th2辅助细胞可促进体液反应中抗体的产生。因此，PCV3感染会抑制动物机体的抗体产生，其结果会增加其他疾病感染的机率和降低疫苗的免疫效果。PCV3的这种免疫抑制或许是临床上疫苗免疫效果低于动物实验数据的原因之一，包括抗体水平离散高、免疫保护差、抗体水平低、免疫起效慢等。如何应对PCV3给疫苗免疫和疾病防控带来的压力与挑战是我们亟待解决的问题。

早在2018-2022年间，杨汉春教授团队通过对全国17个省市的2707份病原流调时就发现PCV3阳性率为31.07%，最近的研究显示PCV3的整体阳性率已超过35%，病毒感染进一步增加。最新研究数据显示，PCV3在哺乳猪睾丸液样本和母猪中检出率分别为46.1%和75.4%，远高于PCV2的检出率；一些省份PCV3阳性率也远超35%，且出现疾病猪PCV3阳性率比无明显临床症状猪高出了40.64%。PCV3与其他病原混合感染较为严重，特别是PCV2与PCV3共感染超过50%，而考虑到PCV3的免疫抑制，PCV2疫苗及其他疫苗的临床免疫效果必然会大打折扣。临床上已有多起免疫PCV2仍然感染发病的案例，这可能主要是PCV2和PCV3共感染引起的，并非仅仅是因为毒株不匹配或交叉保护力低等原因。

 

图1 14个养猪省份PCV3的阳性检出情况

（数据来源：Cao M et al, Front Microbiol., 2024. 参考文献8）

 

 

图2 疑似圆环病中PCV3与其他病原的混合感染情况

（数据来源：Cao M et al, Front Microbiol., 2024. 参考文献8）

以上数据均表明，PCV3可引起严重的危害。幸运的是，现在许多养殖企业已认识到PCV3的危害，也明白单纯的依靠卫生管理和物理隔离等来防止圆环的感染是十分困难的。圆环病毒抗逆性较强，疫苗免疫是应对圆环感染的最有效手段，未来的疫苗方向一定是包含PCV2和PCV3的联苗形式。考虑到PCV2国内外已经存在的巨大市场及PCV3的广泛分布，PCV3疫苗的市场需求将不低于PCV2，特别是与PCV2联合开发二联苗或者多联苗将替代现在的单独的PCV2疫苗，实现对猪圆环病的更好防控。仅以2024年PCV2疫苗6亿多头份的销售量来看，即使按照2元的价格销售PCV3疫苗，其市场就已超过10亿。在PCV2疫苗加速内卷的情况下，首先上市PCV3疫苗的企业有望在动保行业洗牌的情况下拿下猪圆环疫苗市场，并在整个动保领域占据更大的市场份额。

2.PCV3疫苗研制主要难点

虽然PCV2的全病毒灭活疫苗，以及利用大肠杆菌或昆虫杆状病毒表达系统制备的VLP疫苗均有成熟的市场化产品，但根据文献报道和动保企业的研发进展来看，PCV3疫苗的研制存在多个难点。包括病毒的分离培养、攻毒模型建立、评价指标、蛋白表达、VLP纯化等多个方面，主要难点见表1。

表1 PCV3疫苗研制的主要难点分析

 

PCV3病毒分离培养困难，较难得到高效价的病毒，因此未来开发全病毒灭活疫苗的难度是非常大的。以重组蛋白表达来制备疫苗，比以病毒扩增为基础的传统疫苗制备则相对简单和经济，因此PCV3疫苗的研制也多集中在以PCV3 Cap为基础的重组亚单位或者VLP疫苗上，但PCV3 Cap蛋白的高效可溶表达和纯化是PCV3亚单位/VLP疫苗经济高效制备需要重点解决的难题。

3.PCV3疫苗研制行业主要格局

目前PCV3疫苗研制有竞争实力的企业主要为普莱柯、国药动保、科前生物和金宇生物。

表2 猪PCV3疫苗临床试验申请数据

（数据来源：国家兽药基础数据库）

 

普莱柯

截至目前，普莱柯与洛阳惠中联合申报了3项PCV3相关疫苗，均处于临床试验阶段，并采用昆虫杆状病毒表达系统制备。具体包括：猪圆环病毒2型、3型二联亚单位疫苗：针对PCV2和PCV3的流行毒株，实现“一针两防”；猪圆环病毒3型亚单位疫苗：聚焦PCV3单一病原，抗原纯度高，可诱导特异性免疫反应；猪圆环病毒2型、3型、猪肺炎支原体三联灭活疫苗：整合三种抗原，减少接种次数，适应规模化养殖需求。

科前生物

科前生物获得重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用的发明专利授权。该专利通过优化抗原表位设计，在大肠杆菌中实现高效表达，制备的亚单位疫苗可诱导实验猪产生高水平抗体，对PCV3感染具有显著保护作用。该技术创新为PCV3疫苗研发提供新路径。另据悉，科前生物也在加速昆虫杆状病毒表达系统制备PCV3 VLP疫苗。

国药动保

国药动保与国药集团下属公司扬州威克合作申报的猪圆环病毒3 型杆状病毒载体灭活疫苗（AH19 株）临床试验，为国内第一个关于PCV3疫苗的临床试验。该疫苗同样采用昆虫杆状病毒表达系统生产。

金宇生物

根据金宇生物对外宣传，其制备的PCV3 VLP疫苗已进入动物评估阶段，该疫苗亦是通过昆虫杆状病毒表达系统制备，电镜下观察显示病毒粒子稳定性良好，纯化后抗原含量较高，因此在PCV3疫苗上也取得了较大突破。

普莱柯在临床申报上布局了3种疫苗类型，处在行业的前沿，一旦二联或三联疫苗获批上市，将有可能迅速占据猪圆环疫苗市场大部分份额；国药动保作为昆虫杆状病毒表达制备PCV2 VLP疫苗的龙头企业，必然积累了丰富的原创技术，在PCV3疫苗制备上可能具有更优的技术和工艺，市场竞争能力较强；金宇和科前生物作为猪圆环疫苗销售前三的企业，本就拥有雄厚的研发实力、目前虽未见临床试验申请，但PCV3疫苗临床前的工作或将完成，等待申报。

4.昆虫杆状病毒表达系统或是彻底解决PCV3疫苗研制难题的高效平台

PCV3 Cap蛋白无糖基化，理论用大肠杆菌进行表达更加经济方便，但临床申请的几项疫苗中，PCV3疫苗确均以昆虫杆状病毒杆状病毒表达系统制备。普莱柯原核表达PCV2 Cap蛋白制备VLP疫苗的工艺已经非常成熟，但PCV3疫苗的制备这次更换为昆虫杆状病毒表达系统，原因可能在于以原核表达制备PCV3 Cap蛋白存在一些较难解决的产业化难题。另外，PCV2和PCV3 Cap蛋白尽管都无糖基化，但存在的磷酸化位点，可能会影响蛋白VLP的组装或结构，进而影响免疫原性，而原核表达系统磷酸化的缺陷可能也是在动物疫苗VLP制备中的不利的一个因素。详细查阅文献发现，一些科研机构和动保企业等尝试过多种大肠杆菌表达策略来制备PCV3 Cap蛋白，但如“PCV3疫苗研制主要难点”中指出的一样，表达的蛋白多数存在不可溶、难纯化、不能形成VLP或者纯化效率很低等问题，目前仍未有很好的解决方案来实现VLP在大肠杆菌上的高效制备，这暴露了大肠杆菌表达系统在PCV3疫苗制备中重要缺陷。

表3 不同表达系统表达和制备PCV3 Cap蛋白的相关研究

 

作为比较，PCV3 Cap蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达形式则相对简单，可不设计多种截短型，全长即可表达，并可自组装形成VLP，完整保留抗原信息。最为重要的是，尽管目前多数研究显示采用昆虫杆状病毒表达系统表达PCV3 Cap时蛋白可溶表达量相较于PCV2较低，纯化工艺也可能尚不成熟，但是经过优化后的蛋白表达量已有较高提升且能够纯化，实现了0到1的规模化突破，这加速了疫苗研发和评估。此外，通过序列替换和N端的进一步改造，可能会进一步提高蛋白的可溶表达水平，从而降低生产成本。而临床申报的几家动保企业或许已经攻克了蛋白高可溶表达的技术难题，实现了PCV3疫苗的低成本生产。

昆虫杆状病毒表达系统制备的PCV2 VLP疫苗是市场的主要疫苗形式，其免疫原性比大肠杆菌表达系统制备的VLP好，市场认可度高，PCV3也采用此表达系统除了更利于与PCV2配制联苗外，也更符合市场需求。另有研究考虑到PCV3病毒培养和蛋白表达纯化等困难，以mRNA形式进行疫苗开发，由于mRNA的疫苗效果与抗原的序列设计非常相关，因此也需要验证设计的序列是否能够较好表达蛋白和形成VLP。此外，从疫苗生产条件上看，目前动保企业中，仅瑞普生物“mRNA疫苗”生产线于今年2月份通过静态验收，mRNA疫苗从设计到实际应用，还需要一段时间，且需充分验证其效果、储存和运输及临床使用的方便性等。

因此，综合来看，昆虫杆状病毒表达系统是目前最利于PCV3疫苗研制的平台，也是突破和进展最快的平台。相信再经过一段时间的优化研究，其或将彻底解决PCV3疫苗研制难题。

✦ 劲帆医药

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劲帆Bac/Sf9系统通过解决传统Bac-to-Bac技术的核心问题，为重组蛋白的生产提供了更高效、更稳定的解决方案，其高效的重组效率、高水平的表达能力、优良的传代稳定性以及高批间一致性，使其在大规模生产中具有显著优势，为疫苗开发、生物制药和科研领域带来了重要的技术突破。

劲帆医药在多个VLP表达上，均实现高水平稳定表达，为VLP预防或治疗性疫苗、mRNA递送载体、VLP展示疫苗等的开发奠定了基础。其中在PCV2、PCV3中也进一步验证了劲帆Bac/Sf9系统的强表达能力，其中PCV2优化蛋白表达量可达300μg/ml左右，PCV3的优化表达量也可达到150μg/ml左右，同时劲帆也建立了相应的纯化工艺。我们期待，用我们的技术与服务更好地赋能客户，高效制备高价值疫苗。